利用侧流核酸试纸条快速检测非洲猪瘟病毒(2)
(1)
另外,为了确保试验的可用性以及LFNAA的特异性,提取了感染ASFV、感染猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CFSV)、以及健康猪的血液DNA,用紫外分光光度法检测提取的DNA的浓度,其浓度均介于10~20 ng/μL。同时,由本实验室保存的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪圆环病毒1型(Porcine circovirus 1, PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2, PCV2)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus virus, PPV)的基因片段DNA,进行交叉反应检测。
1.3 试纸条的组装
如图1所示,试纸条的检测线(T线)和质控线(C线)分别用试纸条喷膜仪(Biodot XYZ3060)喷涂5 mg/mL的链霉亲和素(streptavidin, SA)和质控探针(提前将1 mg/mL SA与100 μmol/L生物素化的控制探针在室温下孵育2 h[19])。然后,将试纸条在37 ℃下干燥2 h,用切条机(KM-3100)切成宽度为4 mm的试纸条,密封保存。
图1 测流核酸测定试纸条的原理Fig.1 Pattern of lateral flow nucleic acid assay (LFNAA)
1.4 引物的设计和修饰
参照PCR引物的设计原理,使用Primer 5.0软件对ASFV p72基因进行引物设计。然后,按照试纸条的设计模式,对引物进行修饰。为了使PCR扩增在一个特殊的无碱基位点上终止,我们在反向引物的5′端标记Spacer C3,并随后连接一个寡核苷酸片段作为尾巴,从而形成尾引物。正向引物标记生物素。同时,为了确保LFNAA的可用性,捕获探针与寡核苷酸尾巴互补,控制探针与捕获探针的核苷酸序列互补。引物和探针由上海生工生物公司合成(表1)。
表1 引物和探针的序列Table 1 Sequences of primers and probes引物/探针Primers/Probes核苷酸序列(5′-3′)Nucleotide sequences 引物PrimersF: Bio- GCGCAACTTAATCCAGAGCGR: TTGGTCGTGGTGGTGGTTT-Spacer C3- CCTATCACGGACGCAACGTA 捕获探针Capture probeAAACCACCACCACGACCAA(T)15-HS-SH C6 质控探针Control probeBio-TTGGTCGTGGTGGTGGTTT
1.5 胶体金AuNPs和金标捕获探针的制备
参考前人对胶体金试纸条的制备[13,15],采用柠檬酸三钠还原法[20]制备13 nm AuNPs。将2.0 mL 194 mmol/L的柠檬酸钠溶液快速加入到沸腾的100 mL含有0.1% HAuCl4溶液中,当溶液的颜色由紫色变为红色时,表示AuNPs的形成。将溶液冷却至室温,储存于4 ℃。
制备金标捕获探针[21-22]。将20 μL 100 μmol/L的捕获探针缓慢滴加到500 μL 13 nm的AuNPs中,在黑暗中静置16 h,然后滴加56 μL 10 mmol/L的磷酸盐缓冲液(PB Buffer)(NaH2PO4/Na2HPO4,pH值7.4)和92 μL 2 M NaCl溶液,再次孵育8 h后,离心30 min(4 ℃,16 100 g)除去上清液,用0.3 mol/L NaCl(pH 7值)和10 mm PB Buffer洗涤沉淀。最后,将沉淀溶解在含0.3 mol/L NaCl的10 mm PB Buffer中,4 ℃避光保存。
1.6 PCR反应和LFNAA的检测
使用2×Taq Master Mix在普通PCR仪中进行扩增。每50 μL反应混合物包括Mix 25 μL,正向引物和反向引物(10 μM)各2 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 20 μL。将反应溶液充分混合后,按照以下程序进行扩增:94 ℃ 90 s;94 ℃ 3 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,30个循环;72 ℃ 5 min。扩增产物用2% 琼脂糖凝胶电泳或LFNAA进行分析。
LFNAA检测体系:将2 μL PCR产物添加到90 μL TE缓冲液中,加入8 μL金标捕获探针。然后将混合物滴加到试纸条的样品垫上,并在5 min内检查结果。
判定方法:1)当样品中含有ASFV DNA时,金标捕获探针与阳性产物和T线的链霉亲和素形成三明治结构,在T线上显示肉眼可见的红色,同时,过量的金标捕获探针与C线上固定的控制探针结合,在C线上显示红色。此时T线与C线均为红色,当T线的颜色等同或深于C线时,判定为阳性结果;2)当样品中不存在ASFV DNA或者浓度过低不足以检出时,T线不显色,仅C线显示红色,判定为阴性结果;3)当C线不显色时,可以判定试纸条失效。
2 结果与分析
2.1 LFNAA的原理
这项工作开发了一种成本较低的通用型侧流核酸测定试纸条,将传统PCR技术与胶体金试纸条技术相结合,基于ASFV 基因组的高度保守区域设计特异性引物,采用独特的尾引物和胶体金标记的寡核苷酸捕获探针,能够直接检测PCR的扩增产物。如图1所示,LFNAA试纸条包括固定有5 mg/mL链霉亲和素的T线以及固定有控制探针的C线。在检测过程中,带有寡核苷酸尾巴的双链扩增子能与金标捕获探针进行DNA杂交互补。在阳性产物存在的情况下,扩增子另一侧标记的生物素将与T线上的链霉亲和素结合,形成“链霉亲和素-生物素-扩增产物-寡核苷酸尾巴-金标捕获探针”的三明治结构,在T线显示红色,表明阳性结果。相反,如果没有阳性产物,T线就不会有红色反应。而无论如何,过量的金标捕获探针都会继续移动,并与C线上的控制探针杂交结合,显示红色,作为LFNAA的有效对照。
文章来源:《四川动物》 网址: http://www.scdwzzs.cn/qikandaodu/2021/0728/1606.html
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