利用侧流核酸试纸条快速检测非洲猪瘟病毒(5)
该研究将传统PCR技术与胶体金试纸条技术相结合,建立了一种通过核酸检测的LFNAA试纸条,仅需一台普通PCR仪,即可实现快速、简便、灵敏的ASFV鉴别(<2 h),符合基层普通实验室或养殖场等资源有限的实验室中非专业人员的需求,具有巨大应用前景。此外,该技术也将应用于等温扩增技术,以实现更快更简便的现场检测的技术需求。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
2×Taq Master Mix(购自Novoprotein公司)。试纸条的有关材料,包括背板(J-A6)GL04、硝化纤维素膜(CN140)、吸水垫(H-4)(购自Millipore公司)。HAuCl4·4H2O、柠檬酸、TE缓冲液、柠檬酸三钠和链霉亲和素(SA)(购自Sigma公司)。NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl 均为国产分析纯(国药控股化学试剂有限公司)。荧光定量PCR试剂盒(购自Kapa公司)。荧光定量PCR分析采用ABI 7500仪器(购自Applied Biosystems公司)。
1.2 试验用基因片段DNA及核酸样品
参考GenBank中非洲猪瘟病毒主要结构蛋白基因p72基因(GenBank:AY)[17],由上海生工生物公司合成基因片段。将获得的冻干粉用TE缓冲液溶解,并根据如下公式[18]计算拷贝数,最后得到1.75×1010copies/μL的ASFV基因片段。
(1)
另外,为了确保试验的可用性以及LFNAA的特异性,提取了感染ASFV、感染猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CFSV)、以及健康猪的血液DNA,用紫外分光光度法检测提取的DNA的浓度,其浓度均介于10~20 ng/μL。同时,由本实验室保存的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪圆环病毒1型(Porcine circovirus 1, PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2, PCV2)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus virus, PPV)的基因片段DNA,进行交叉反应检测。
1.3 试纸条的组装
如图1所示,试纸条的检测线(T线)和质控线(C线)分别用试纸条喷膜仪(Biodot XYZ3060)喷涂5 mg/mL的链霉亲和素(streptavidin, SA)和质控探针(提前将1 mg/mL SA与100μmol/L生物素化的控制探针在室温下孵育2 h[19])。然后,将试纸条在37 ℃下干燥2 h,用切条机(KM-3100)切成宽度为4 mm的试纸条,密封保存。
图1 测流核酸测定试纸条的原理Fig.1 Pattern of lateral flow nucleic acid assay (LFNAA)
1.4 引物的设计和修饰
参照PCR引物的设计原理,使用Primer 5.0软件对ASFV p72基因进行引物设计。然后,按照试纸条的设计模式,对引物进行修饰。为了使PCR扩增在一个特殊的无碱基位点上终止,我们在反向引物的5′端标记Spacer C3,并随后连接一个寡核苷酸片段作为尾巴,从而形成尾引物。正向引物标记生物素。同时,为了确保LFNAA的可用性,捕获探针与寡核苷酸尾巴互补,控制探针与捕获探针的核苷酸序列互补。引物和探针由上海生工生物公司合成(表1)。
表1 引物和探针的序列Table 1 Sequences of primers and probes引物/探针Primers/Probes核苷酸序列(5′-3′)Nucleotide sequences 引物PrimersF: Bio- GCGCAACTTAATCCAGAGCGR: TTGGTCGTGGTGGTGGTTT-Spacer C3- CCTATCACGGACGCAACGTA 捕获探针Capture probeAAACCACCACCACGACCAA(T)15-HS-SH C6 质控探针Control probeBio-TTGGTCGTGGTGGTGGTTT
1.5 胶体金AuNPs和金标捕获探针的制备
参考前人对胶体金试纸条的制备[13,15],采用柠檬酸三钠还原法[20]制备13 nm AuNPs。将2.0 mL 194 mmol/L的柠檬酸钠溶液快速加入到沸腾的100 mL含有0.1% HAuCl4溶液中,当溶液的颜色由紫色变为红色时,表示AuNPs的形成。将溶液冷却至室温,储存于4 ℃。
制备金标捕获探针[21-22]。将20μL 100μmol/L的捕获探针缓慢滴加到500μL 13 nm的AuNPs中,在黑暗中静置16 h,然后滴加56μL 10 mmol/L的磷酸盐缓冲液(PB Buffer)(NaH2PO4/Na2HPO4,pH值7.4)和92μL 2 M NaCl溶液,再次孵育8 h后,离心30 min(4 ℃,16 100g)除去上清液,用0.3 mol/L NaCl(pH 7值)和10 mm PB Buffer洗涤沉淀。最后,将沉淀溶解在含0.3 mol/L NaCl的10 mm PB Buffer中,4 ℃避光保存。
1.6 PCR反应和LFNAA的检测
使用2×Taq Master Mix在普通PCR仪中进行扩增。每50μL反应混合物包括Mix 25μL,正向引物和反向引物(10μM)各2μL,DNA模板1μL,ddH2O 20μL。将反应溶液充分混合后,按照以下程序进行扩增:94 ℃ 90 s;94 ℃ 3 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,30个循环;72 ℃ 5 min。扩增产物用2% 琼脂糖凝胶电泳或LFNAA进行分析。
LFNAA检测体系:将2μL PCR产物添加到90μL TE缓冲液中,加入8μL金标捕获探针。然后将混合物滴加到试纸条的样品垫上,并在5 min内检查结果。
文章来源:《四川动物》 网址: http://www.scdwzzs.cn/qikandaodu/2021/0728/1606.html
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