利用侧流核酸试纸条快速检测非洲猪瘟病毒(6)
判定方法:1)当样品中含有ASFV DNA时,金标捕获探针与阳性产物和T线的链霉亲和素形成三明治结构,在T线上显示肉眼可见的红色,同时,过量的金标捕获探针与C线上固定的控制探针结合,在C线上显示红色。此时T线与C线均为红色,当T线的颜色等同或深于C线时,判定为阳性结果;2)当样品中不存在ASFV DNA或者浓度过低不足以检出时,T线不显色,仅C线显示红色,判定为阴性结果;3)当C线不显色时,可以判定试纸条失效。
2 结果与分析
2.1 LFNAA的原理
这项工作开发了一种成本较低的通用型侧流核酸测定试纸条,将传统PCR技术与胶体金试纸条技术相结合,基于ASFV 基因组的高度保守区域设计特异性引物,采用独特的尾引物和胶体金标记的寡核苷酸捕获探针,能够直接检测PCR的扩增产物。如图1所示,LFNAA试纸条包括固定有5 mg/mL链霉亲和素的T线以及固定有控制探针的C线。在检测过程中,带有寡核苷酸尾巴的双链扩增子能与金标捕获探针进行DNA杂交互补。在阳性产物存在的情况下,扩增子另一侧标记的生物素将与T线上的链霉亲和素结合,形成“链霉亲和素-生物素-扩增产物-寡核苷酸尾巴-金标捕获探针”的三明治结构,在T线显示红色,表明阳性结果。相反,如果没有阳性产物,T线就不会有红色反应。而无论如何,过量的金标捕获探针都会继续移动,并与C线上的控制探针杂交结合,显示红色,作为LFNAA的有效对照。
2.2 PCR引物和LFNAA体系的验证
以ASFV基因片段DNA为阳性模板,以ddH2O为空白对照,验证PCR引物和LFNAA体系的有效性。如图2a所示,在琼脂糖凝胶电泳中,ASFV的基因片段DNA模板呈现正确的阳性条带,且无拖带现象,而以ddH2O为空白对照的扩增产物没有条带。同样地,当用LFNAA体系检测扩增产物时(图2b),阳性模板在试纸条上显示了2条红线,而空白对照仅在C线上出现红色条带,与以上描述的判定方法相一致。因此,这些结果表明,该引物可以有效地扩增ASFV p72基因,而且这种新型的LFNAA可以应用于实际的检测,具有良好的实用价值。
1. ASFV的基因片段DNA,2. ddH2O1. African swine fever virus (ASFV) gene DNA, 2. ddH2O图2 引物的和侧流核酸测定试纸条的有效性检测Fig.2 Validity of primers and LFNAA
2.3 LFNAA的检测限
将ASFV基因片段DNA按照10倍的梯度进行稀释,其中1.75×105~1.75×102copies/μL 的稀释液用于测定LFNAA的检测限,ddH2O作为空白对照。以琼脂糖凝胶电泳为对照(图3a),DNA模板在1.75×105~1.75× 103copies/μL的浓度范围内(泳道1~3),在电泳中的条带亮度依次降低,而1.75×102copies/μL DNA(泳道4)不能检测出电泳条带。同样,在图3 b,LFNAA试纸条在DNA模板1.75×105和1.75×104copies/μL时(试纸条1和2),T线出现明显的红色反应,DNA模板在1.75× 103copies/μL时(试纸条3),T线出现微弱的红色条带,而模板浓度达到1.75×102copies/μL时(试纸条4),T线无红色反应,仅在C线显示红色。这些结果说明,LFNAA的检测限与琼脂糖凝胶电泳一致,均能检测到103copies/μL的ASFV DNA模板。此外,查阅湖南国测生物科技有限公司开发的荧光定量PCR试剂盒[23]、北京森康生物技术开发有限公司开发的等温扩增试剂盒[24]等中国动物疫病预防控制中心认可的ASFV检测试剂盒的灵敏度,发现该研究的灵敏度与查阅结果相一致。
注:1~4分别为1.75×105、1.75×104、1.75×103、1.75×102copies/μL的ASFV基因片段DNA;5为 ddH2ONote: 1-4 represent 1.75×105, 1.75×104, 1.75×103, 1.75×102copies/μL of African swine fever virus (ASFV) DNA; 5 represents ddH2O图3 琼脂糖凝胶电泳和侧流核酸测定试纸条对ASFV基因片段DNA 的检测限比较Fig.3 Comparison of detection limits of ASFV gene fragment DNA by agarose gel electrophoresis and LFNAA
2.4 实际样品的检测
用OIE推荐的荧光定量PCR技术验证实际样品,确保模板的准确性。参考文献中的引物[25],上游引物为5′-GGTGTTTGGTTGTCCCAGT-3′,下游引物为5′-TAAAGTACGCCCGCATACG-3′,探针序列为5′-FAM-CTGAATCGGAGCATCCTGCCAG-TAMRA-3′。从图4a可以看出,只有ASFV的基因片段DNA(曲线1)和从3份感染ASFV的血液样品中(曲线2~4)提取出的DNA出现扩增,而感染CSFV的猪血液DNA(曲线5),PRRSV、PCV1、PCV2、PRV、PPV的基因片段(曲线6~10),和健康猪的血液DNA(曲线11),以及ddH2O为模板的空白对照(曲线12)均无扩增现象。该结果验证了模板的正确性,可以作为LFNAA试纸条的结果的参考。
在LFNAA试纸条中,ASFV基因片段DNA和3份感染ASFV猪的血液DNA为阳性模板,PRRSV、PCV1、PCV2、PRV、PPV的基因片段,感染CSFV的猪血液DNA,和健康猪的血液DNA为阴性模板,ddH2O为空白对照(试纸条12)。从图4b可以看出,3份感染ASFV猪的血液DNA在T线和C线上均有明显的红色条带(试纸条2~4)与ASFV基因片段DNA(试纸条1)的检测结果一致,表明了LFNAA的实用性。同时,感染CSFV的猪血液DNA(试纸条5),PRRSV、PCV1、PCV2、PRV、PPV的基因片段(试纸条6~10),和健康猪的血液DNA(试纸条11)仅在C线出现一条红色条带,说明了其阴性结果,证明了LFNAA的特异性。
文章来源:《四川动物》 网址: http://www.scdwzzs.cn/qikandaodu/2021/0728/1606.html
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